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      2. 林一瀚課題組在Mol Cell發文 報道TFp300共凝聚調控基因轉錄爆發動力學

        p300和它的同源基因CREB-binding protein(CBP)是轉錄調控過程中發揮重要作用的轉錄共激活因子【1】。p300/CBP的突變或者染色體易位會引起基因表達紊亂和疾病的發生【2】。前人的研究結果表明,p300/CBP至少通過兩種方式來調控基因轉錄【3】。一方面,p300/CBP可以作為橋梁/支架來調控轉錄因子(TF)和其它轉錄相關蛋白的相互作用,提高轉錄的協同性并且穩定轉錄復合物。另一方面,p300/CBP是一個乙?;?,可以對包括組蛋白在內的多種蛋白進行乙?;揎?,但是它發揮功能依賴于臨近的p300/CBP分子對其乙?;瘡亩鴮崿F反式激活【4】。一些研究的結果也表明,p300/CBP調控基因激活可以不依賴于其催化活性【5】。那么p300/CBP的這兩種功能在細胞內是如何與特定的TF一起協同起來調控下游基因轉錄呢?

        2021年3月1日,北京大學前沿交叉學科研究院定量生物學中心、北大-清華生命科學聯合中心林一瀚課題組在Molecular Cell在線發表題為“Co-condensation between transcription factor and coactivator p300 modulates transcriptional bursting kinetics”的文章?;诤铣缮飳W、單細胞定量成像等手段,該研究的結果表明,p300可以通過其無序序列(IDR)與部分轉錄因子的反式激活域(TAD)相互作用,形成動態的聚集體來協調上述兩種功能。TF/p300的共凝聚使p300在細胞內局部聚集,促進其反式激活反應,實現對p300催化活性的空間特異的激活,進而協助包括Brd4在內的下游共激活因子的招募。在目標基因調控層面,TF/p300的共凝聚可以影響目標基因轉錄的起始速度、轉錄爆發的持續時間等定量參數,實現非線性的激活響應。據此,該文提出了一種基于TF/p300共凝聚的基因調控模式,為理解細胞如何實現時空特異的基因激活提供了新見解。

        研究人員首先在mESC、U2OS和SK-N-AS等細胞系中利用活細胞成像或者免疫熒光成像等手段觀察到了p300聚集體的存在,并且發現聚集體的數量受到細胞周期及細胞大小影響,并與特定轉錄因子存在刺激依賴的共定位現象?;凇皁ptoDroplet”實驗的思路【6】,研究人員發現藍光誘導轉錄因子TAD自聚集可以招募p300并形成共凝聚物。通過進一步定量分析,研究人員發現不同的TAD與p300形成共凝聚物的能力差異較大,例如p65TAD的能力大于p53TAD。過表達p300可以促進光誘導凝聚物的形成,并提高凝聚物的穩定性。此外,天然二聚化的轉錄因子rTetR或者轉錄因子的多聚化結構域(如p53的四聚化結構域,TD)均可促使TAD與p300形成共凝聚物。p300有約60%的無序序列,通過對p300的不同片段進行分析,研究人員發現其NTR1(氨基酸1-566)和CTR(氨基酸1856-2414)在p300形成凝聚物以及與TAD形成共凝聚物的過程中發揮主要作用。CTR富含谷氨酰胺(~20%),將其突變成丙氨酸后可以削弱其形成凝聚物的能力。

        進一步的數據顯示,TF/p300的共凝聚促進了p300的自激活(p300 K1499ac),且由于p300含有Bromo結構域(可以識別乙?;馁嚢彼幔?,因此猜測p300自激活可能提供了基于乙?;嚢彼岬恼心紁300的能力,形成潛在的正反饋機制來促進聚集體的生長。為了驗證此假說,研究人員利用p300酶活性抑制劑A-485處理細胞,發現較大的TF/p300聚集體很快被解聚成小的聚集體。雖然該現象符合上述假說,調控該聚集體的生長調控機制仍需要進一步探討。更多的活細胞成像數據暗示,TF/p300的共凝聚讓p300以類似“all-or-none”的方式在空間位置上被激活,進而催化乙?;揎?、招募Brd4,該招募強度與TF/p300形成共凝聚物的能力正相關。

        圖1 TF/p300共凝聚物激活基因轉錄

        為了探究共凝聚現象的基因調控功能,研究人員首先在瞬轉體系中利用實時轉錄報告系統展示TF/p300共凝聚物能以時空特異性的方式激活基因轉錄(圖1),然后構建了穩定整合有十余個能同時報告轉錄和蛋白表達的基因位點的細胞株,并在該細胞株中轉入多種TF用于分析。通過比較rTetR-p65TAD和rTetR-p53TAD調控的下游基因表達的差異,研究人員發現TF與p300形成共凝聚的能力可能與下游基因激活的強度以及與響應曲線的非線性相關。為了驗證這一假說,研究人員嘗試去調控p53TAD與p300形成共凝聚物的能力,構建了rTetR-p53TAD-p300CTR,rTetR-p53TAD-p300CTR(Q2A),rTetR-TD-p53TAD等合成轉錄因子。對這些TF介導的目標基因激活進行定量分析的結果支持上述假說,但比較有趣的是,四聚化結構域雖能提高目標蛋白表達水平,對響應曲線的非線性卻沒有增強。通過定量活細胞實時轉錄成像,研究人員發現TF/p300共凝聚調控了轉錄爆發的起始速度,持續時間和激活的基因個數等參數,一定程度上解釋了在目標蛋白層面上所觀察到的現象?;谇叭烁咄繑祿姆治鼋Y果進一步支持了上述成像數據所觀察到的現象。

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        圖2 基于TF/p300共凝聚的基因調控模式

        綜上,該研究提出了一種基于TF/p300共凝聚的基因調控模式(圖2),為理解轉錄凝聚體如何參與基因調控【7-10】提供了新的數據,但尚未對共凝聚體形成的物理化學機制進行深入細致的闡述。需要指出的是,當前領域內關于轉錄凝聚體是否、以及如何參與基因調控存在數種見解,雖然本研究中作者嘗試了不同手段去驗證TF/p300共凝聚與轉錄調控的潛在因果關系,但仍期待更多的數據來測試其它可能的假說。

        北京大學前沿交叉學科研究院定量生物學中心、北大-清華生命科學聯合中心林一瀚研究員為本論文通訊作者,前沿交叉學科研究院博士研究生馬良為第一作者,前沿交叉學科研究院博士研究生高澤悅、謝雨晨和黃雯,清華大學生命學院博士研究生吳結根和鐘碧俊瑤為本論文的共同作者。該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金以及北大-清華生命科學聯合中心的資助。

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